为什么要表达融合蛋白,只克隆和表达目标蛋白是否可行
融合蛋白 - 技术概况 融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。 融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。
融合蛋白 - 技术概况 融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。 融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则 ，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。
蛋白表达用哪种表达方式比较好呢？常用的表达方式是哪种呢
蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。在基因工程技术中占有核心地位。
蛋白表达系统概述
蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成：
1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。
2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。
3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。
原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统，也是最经济实惠的蛋白表达系统。原核蛋白表达系统以大肠杆菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的几率较小。
酵母蛋白表达系统以甲醇毕赤酵母为代表，具有表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵等优点。缺点为部分蛋白产物易降解，表达量不可控。
哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生物活性，缺点是表达量通常较低，稳定细胞系建立技术难度大，生产成本高。
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表达小分子蛋白有什么技巧
蛋白质基因融合技术中，常见的标签有
His6，六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析，对重组蛋白进行分离纯化。
GST，谷胱甘肽巯基转移酶标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。一般可以利用它增加外源蛋白的可溶性。
MBP，麦芽糖结合蛋白标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。
SUMO，SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白，是泛素类多肽链超家族的重要成员之一。
融合基因的两个启动子相连，蛋白会表达吗
融合基因的两个启动子相连，蛋白会表达
融合蛋白是指在基因工程迅速发展的基础上，通过DNA重组技术将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因表达后所得的蛋白质产物。融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。 融合蛋白有两种不同的含义，一种是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。另一种含义就是介导两个细胞质膜融合的一组蛋白，如在仙台病毒脂双层外侧小叶中含有的两种糖蛋白之一，介导病毒被膜与宿主细胞质膜的融合作用。另一种糖蛋白是血细胞凝集素神经酰胺酶。 两个不同的蛋白质连成一个大分子。可以通过化学方法连接，也可通过基因的融合来实现。在基因操作中，对一些分子数小的多肽基因常采用融合的方法与某一基因（如lac）相连，二者之间接上某一酶（如凝血酶）的切口，以增加在体内表达后产物的稳定性，也有的故意使两个分子串连融合以提高疗效，如IL-3与GM-CSF。也有与分泌性蛋白的信号肽基因组成融合基因，以使表达产物分泌到膜外或胞外。 在基因工程迅速发展的基础上，有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因连接在一起，进而表达所需蛋白，这种通过在人工条件下将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因表达后所得的蛋白质产物称为融合蛋白。
检测蛋白质表达量的实验方法有哪些，western-blotting的原理，方法
蛋白质印迹（免疫印迹试验）即Western Blot物、物化免疫遗传用种实验其基本原理通特异性抗体凝胶电泳处理细胞或物组织品进行着色通析着色位置着色深度获特定蛋白质所析细胞或组织表达情况信息
蛋白质印迹由瑞士米歇尔弗雷德希物研究所（Friedrich Miescher Institute）Harry Towbin1979提尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981所著《析物化》（Analytical Biochemistry）首称Western Blot蛋白免疫印迹（Western Blot）电泳离细胞或组织总蛋白质凝胶转移固相支持物NC膜或PVDF膜用特异性抗体检测某特定抗原种蛋白质检测技术现已广泛应用于基蛋白水平表达研究、抗体性检测疾病早期诊断等面
蛋白的表达与纯化
蛋白表达纯化已经是非常经典简单的实验了，没有LSS说的那么吓人。
说说我的蛋白表达纯化以及下面的单抗制作工作总体设计概要吧：
1 首先要知道你要纯化蛋白的编码DNA序列，查阅相关文献，看目的基因在那些细胞或者组织中高表达，进而设计该基因的引物，扩增出目的DNA片段的ARF。这一布叫目的基因片段的获取
2 构建表达载体：根据你获得的基因本身的特性确定原核或者真核载体中表达，这一步的主要问题就是构建带有目的基因的质粒，导入表达系统中。一般原核表达时间短，成本低，表达量大，常优先考虑；但是有些基因在E coli中就是表达不出，可能是密码子优化等出现问题，也或者是由于想纯化得到更好的活性蛋白的考虑（原核的蛋白折叠系统显然没有真核的好），有很多研究者选择在毕赤酵母中表达。（我手里就有相关资料，因为以前做过表达纯化及后来的单抗制备），这一步再强调一下，优化密码子对于蛋白的成功表达很重要
3 载体构建好了，下面就是重组蛋白的表达了。这一过程涉及到用多少的诱导剂，诱导多少时间才能得到最多的蛋白的问题，即优化表达条件。就是在上述不同量诱导剂诱导条件下，取菌体上清（分泌型）或者破碎细胞（胞内表达的蛋白）电泳，看是否得到目的分子量大小的蛋白
4 蛋白表达成功，下面是根据蛋白质本身亲水/疏水，电荷带电特性等确定蛋白纯化的方法。一般步骤：离心，取蛋白所在的相
如果是分泌表达的蛋白，则取上清，超滤，没有超滤仪器可以用透析袋等代替，用离子交换柱层析。基本上这一步能得到纯化的95％的蛋白，电泳鉴定基本不会看到有杂带出现。如果还是纯度不符合要求，可以在表达蛋白最初在构建表达载体质粒的时候在蛋白的ORF后面加上HIS－标签，这样得到的蛋白不但可以用于HIS柱的进一步纯化，在不确定自己的融合蛋白是否有表达的时候，也可以单单用抗HIS的抗体做一WB，分析确认目的蛋白是否表达，这是蛋白表达的常用手段。
5 经过纯化后的蛋白仍然含有一部分无机盐，如果需要的话可以将蛋白经真空冻干机冻干，得到纯蛋白。
我们实验室做出来的一个蛋白，编码序列GC含量高75达％，但是功夫不负有心人，只要你想做那件事情，积极的寻找解决问题的手段，总会搞定的，没有跨不过的坎。如果坎太宽，搭桥解决总行。
如何提高蛋白质的表达量
我想你这么问应该是做recombinant
protein，那么最常见的办法就是换promoter，换成更强的promoter用来过表达。如果你是在E.coli里面表达的话，我想应该是用的pET
system吧，这样一个是换载体，试试不同的载体，还有就是增加IPTG的量，适当提高诱导温度，延长诱导时间。常规的办法就是这些了。
蛋白质表达检测有哪几种方法
有三种，第一是用DNA探针检测，看目的基因是否存在。第二种是用mRNA做探针，看是否有由DNA转录形成的mRNA，原理和前面是一样的，利用碱基互补配对原则。前面两种都是在分子水平检测，第三种是在个体水平直接检测的。比如：直接拿害虫去侵蚀抗虫棉